样品前处理或溶液配制过程引起主化合物和杂质的流失

有些产品在样品前处理过程中会引发部分挥发性杂质的流失，或在溶剂提取过程中出现难溶性杂质与辅料结合导致未被完全提取的情况（如一些杂质与辅料发生螯合），或溶液配制过程中过滤操作导致杂质吸附性损失。可采用如下方法确定和排除上述因素：

1）样品前处理过程中规避研磨操作，考察研磨和非研磨操作处理样品得到的检测结果差异，如差异性较大则寻求合适的研磨环境及条件。

2）更换提取能力更强的稀释剂，增加稀释剂提取能力，并将前后的考察结果进行比较。比如怀疑样品中有杂质可能与含金属离子的辅料发生螯合时，可尝试在稀释剂中添加少量金属螯合剂，减少杂质与辅料的螯合。

3）采用离心替换过滤，避免待测物的吸附性损失。

主化合物和杂质在样品基质、包装材料、硬件设施中丢失或被吸附

在某些情况下，由于不溶性、挥发性或吸附损失，主化合物和杂质会从检测样品中被除掉。可采用如下方法确定和排除上述因素：

1）不溶性的问题一般采用目视观察或浊度检测可能会发现。曾进行某个碱性原料药的强制降解，由于该原料药在碱性环境中不易溶解，在酸碱破坏试验过程中，在终止破坏时即进行酸碱中和时只要溶液体系加的碱溶液稍微过量，就出现主化合物以透明液态颗粒的形态析出，析出物不太明显，定容时未留意有不溶性物质，导致出现了质量不守恒。这种情况下，向体系中增加一点点的酸助溶，解决了主化合物析出的问题。

2）如果降解产物中含有挥发性杂质，如某些β-内酰胺类化合物在高热条件下下易降解出一些气体杂质，高温试验时采用可承受膨胀且可观察的密封的包装方式（如用铝箔袋进行密封）进行试验，完成破坏后如发现包装袋发生膨胀，基本可确认降解杂质中含有气体。这种情况下采用供试品溶液进行高温破坏可能更加合适，避免或减少了气体降解杂质的产生；或设计试验让降解在较低温下产生使样品保持低温以最小化挥发性。如实在无法避免气体降解杂质，可考虑以顶空方式捕获降解样品。

3）主化合物和杂质有时候可能会吸附在辅料和包装容器中，在研究过程中可尝试使用溶解性能更好的溶剂对辅料和包装容器进行提取，考察提取液中是否检测到主化合物和杂质。在质量研究初期，应对包材的选择进行全面的研究，考察不同的包装方式对产品的影响，尽量避免或减少吸附。

4）少数情况下，降解产物与色谱柱填料发生反应在色谱柱上产生了死吸附，导致杂质检出量降低，质量不守恒。因与填料发生反应而产生的死吸附一般很难冲洗出来，即使增大分析方法洗脱能力也未见良好的效果。这种死吸附往往容易破坏柱床，长久进此类破坏样品会伴随着柱效与柱压的改变。欲确认是否发生死吸附，可使用不接色谱柱分析破坏样品，如尝试使用双通或长毛细管柱代替色谱柱，将获得的总峰面积与使用色谱柱时获得的总峰面积进行比较。这种诊断方式的潜在困难是不接色谱柱时所有化合物均无保留，一般会形成一个无保留的峰，且这个峰易受溶解样品溶剂的影响，若溶剂与流动相有很大不同，则溶剂对样品响应的影响可能会使在没有色谱柱的情况下难以进行准确的积分。这种情况可将待测溶液用流动相进行适当的稀释，避免产生溶剂效应，同时能避免色谱峰发生过载导致定量不准确。如果在接色谱柱时获得的总峰面积明显小于不接色谱柱时的总峰面积，则HPLC方法中存在一些杂质与色谱柱发生了死吸附，当发生死吸附时实验员应考虑更换分离体系。

分析方法的局限性和不适用性

检测方法不适用是质量不守恒中的常见因素之一，表现为未能建立合适的检测方法检出所有的降解产物，使主成分降解后测定的回收量偏低，如降解为无紫外吸收的小分子物质（现有方法检测器检测不到），或形成极性小的聚合物（现有方法没有洗脱出来），或降解产物在现有方法波长下与主峰响应因子差异大导致定量不准确，或降解产物与主峰共洗脱（杂质被包裹在主峰内，两者响应不一致时可影响质量守恒计算），或降解产物与溶剂峰、辅料峰共洗脱（杂质被包裹，直接被去除积分）。

针对上述问题，解决方案如下：

1）降解产物没有紫外吸收，检测器检测不到

紫外吸收光谱是由于分子中价电子（含形成单键σ电子、形成不饱和键的π电子、未参与成键的n电子）的跃迁而产生的，药学研究中的紫外吸收一般由π→π*或n→π*跃迁（主要在200~400nm之间有吸收）产生。当降解产物分子结构中未含有π电子的基团时，检测器即有可能检测不到这些降解产物。这种情况下，常使用更低的波长或使用其他检测器（例如质谱法（MS）、带电气溶胶检测（CAD）、蒸发光散射检测（ELSD）、或火焰电离检测（FID）等），考察不同检测器类型下破坏样品的杂质分布情况，确认或排除该因素的影响。如降解产物中出现比较大量的无紫外吸收的杂质，实验员可考虑更换更适宜的检测器对破坏样品进行检测。

在研发工作中曾遇到一抗菌药物质量不守恒的案例，该案例中主化合物分子结构中硝基咪唑环上连接的侧链均为饱和基团，产生的跃迁类型为σ→σ*跃迁（吸收一般在小于150nm的远紫外区）和n→σ*跃迁（吸收一般在小于200nm的远紫外区），在进行强制降解过程中发生了强破坏样品出现严重质量不守恒现象。在进行研究时从主化合物分子结构进行分析，该药物在发生降解时，硝唑环的降解可能会产生一些没有生色团、无明显紫外吸收的降解杂质。基于上述的理论分析将该产品的破坏样品进行液相质谱联用分析，对比破坏样品的紫外信号及质谱信号，如下图3-1。

图 3-1

图 3-2

图 3-4

降解产物复杂性或色谱柱性能不良导致积分不准确

有些情况下，当药品尤其是液体制剂药品在发生比较复杂的降解（如降解剧烈导致杂质种类众多或发生多级降解）时，尽管它们可能从HPLC色谱柱上洗脱下来，但会在有关物质图谱中以鼓包、驼峰、宽峰或扁平峰的形式存在，甚至不成峰型或不会显示出离散的峰而是基线升高，此类杂质很容易被“遗漏”并保持未积分状态。运行空白对于确定基线升高是来自样品还是属于色谱假象，非常有帮助。在进行某注射液强制降解样品的不守恒研究时，发现其高温破坏样品有关物质检测时以一个宽峰、鼓包的形式存在（如图4-1），当放置的温度越高放置时间越长，鼓包越明显。

图 4-1

在通过制备分离获得该“鼓包”后，通过高分辨质谱、核磁共振氢谱确认该“鼓包”为多种化合物组成的混合物，而在常规积分模式中这种鼓包峰是没有被积分的。此时就需要采用特殊的积分处理手段，重新考察质量守恒值，最终物料达到了平衡。

针对这种降解产物复杂形成的鼓包峰，建议在研究过程先尝试解析出“鼓包化合物”的可能结构，通过质谱、核磁和紫外考察降解杂质的特点，进而选择合适的手段对这类降解杂质进行控制。比如，针对图4.1中的高温样品中的鼓包杂质，在研究过程中从鼓包上不同位置分别提取了紫外吸收光谱，发现不同位置上杂质具有一定相关性，且主要在高波段（580nm~800nm）都产生了吸收，在低波段处的紫外走向则不完全相同，说明了引起鼓包的为混合物，是由多个相似结构的化合物组成的，这些化合物存在极性差异，最终在色谱图上以一个大的宽峰的形式体现出来，这种情况可通过其它特殊的方式对该类杂质进行控制。