GLP-1药物杂质鉴定困难，一维去盐LC-MS提供完美解决方案
发布时间：
2024-05-27
作者：
晨辰医药
来源：
晨辰医药公众号
近年来，司美格鲁肽与替尔泊肽等GLP-1多肽药物取得了巨大成功，成为糖尿病和减重治疗的“明星药品”。让人惊喜的是，多项临床研究及科研报道表明，GLP-1多肽药物还具有降压、改善血脂以及保护心血管和肾脏等诸多作用，具有成为万能神药的潜力。独特的临床疗效让多肽药物正成为越来越重要的药物类别和研发热点。杂质是药品最为关键的质量属性，杂质鉴定是多肽药物研发过程中的重点和难点。针对多肽类药物的杂质鉴定存在的困难，长沙晨辰医药提出了一维在线除盐LC-MS技术方案，并证明其能很好地应用于GLP-1多肽类药物杂质的快速准确鉴定。
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二维去盐LC-MS针对多肽药物杂质研究存在的痛点
近些年来，质谱技术发展迅速，QE及Q-TOF等仪器能提供高质量的一级与二级高分辨率质谱数据，能帮助快速准确鉴定药物杂质结构。然而，多肽药物有关物质分析方法多采用含磷酸盐、离子对等的RP-HPLC方法，不能直接进质谱仪分析。为了解决含盐方法与质谱不兼容问题，各大仪器厂家都已推出了基于阀切换的二维去盐LC-MS技术及配套仪器设备。二维去盐LC-MS能解决部分含盐HPLC方法质谱分析问题，但针对多肽类杂质的质谱鉴定依然困难重重。多肽类药物杂质数量众多，且其结构、性质与主成分往往较为相似，有关物质分析方法难以实现主峰与各个杂质及各杂质间充分分离，基于阀切换的二维去盐LC-MS难以切到干净的目标杂质峰流分，所得到的第二维LC-MS谱图往往具有多个组分的MS信号，从而导致无法正确判断哪个是目标杂质的MS信号。另外，二维去盐LC-MS还存在其它多个缺陷，比如切峰时会有严重流分损失导致灵敏度低；第二维HPLC方法常使用大梯度方法，且一般使用与质谱兼容但背景高的甲酸，会导致背景高、鬼峰多、目标杂质峰识别困难；当有多个杂质峰需要MS鉴定时，二维切峰工作量大，效率低。
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一维在线除盐LC-MS能完美应用于多肽药物杂质研究
图1，长沙晨辰医药搭建的一维在线除盐LC-MS技术原理示意图
针对在线二维LC-MS方法在多肽药物杂质研究存在的缺点，长沙晨辰医药开发出了一维在线除盐LC-MS技术，并在实验室搭建了多套基于QE及Q-TOF等高分辨质谱的一维在线去盐LC-HRMS/MS系统。一维在线除盐LC- MS技术原理如图1所示，即在HPLC流路进入质谱离子源之前相继接了一个阴离子抑制器和阳离子抑制器，能在线去除小分子量的阴离子和阳离子，从而实现含盐HPLC方法直接质谱分析。一维在线除盐相当于是HPLC与质谱直接相连，HPLC的UV色谱图与质谱的总离子流图完全对应，因此能准确识目标杂质的质谱信号。当然，一维去盐LC- MS也存在应用局限，目标杂质在流动相中可能会电离，因而也有被抑制器在线去除的风险。为了规避该风险，晨辰医药搭建的在线去盐装置具有分子量选择性，电离物质分子量越小越容易去除，分子量越大越不容易去除。多肽类药物及其杂质一般分子量较大，在线去盐装置对其完全没有伤害。因此，晨辰医药开发的一维在线去盐LC-HRMS/MS技术能完美地匹配多肽含不挥发盐有关物质方法的LC-MS鉴定分析。
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高分辨率质谱解析算法软件
多肽等生物大分子的质谱数据比小分子复杂得多，通常需要利用计算机算法和软件对数据进行解析，从而获得生物大分子的结构信息，这是多肽药物杂质质谱分析的难点。晨辰医药算法团队利用机器学习算法对大量真实多肽药物杂质质谱数据进行分析，开发出多肽药物杂质理论质谱图谱算法和新的肽图比对机制，可直接对未知多肽杂质进行质谱数据解析，准确获取相应的结构信息。利用该算法，能成功对各类多肽药物的缺失肽、插入肽、错结肽等杂质进行结构解析。
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一维在线除盐LC-HRMS/MS在多肽药物杂质研究应用案例分析
替尔泊肽原料药中未知杂质鉴定
客户替尔泊肽有关物质方法含有磷酸盐，与质谱不兼容，主峰前后有4个杂质明显检出，客户曾尝试过使用二维去盐LC-MS鉴定杂质结构，但以失败告终。长沙晨辰医药接受客户的委托后，使用一维去盐LC-MS对该4个杂质成功进行了鉴定。
图2，一维在线除盐LC-HRMS/MS下的HPLC-UV图和TIC图
图2为替尔泊肽含盐有关物质方法HPLC-UV色谱图及通过一维去盐直接进QE质谱分析所得到的TIC谱图。UV色谱图与相应TIC谱图各杂质峰完全一一对应，从而能准确无误地获得各杂质的一级与二级高分辨率质谱图。采用高分辨率质谱解析算法软件对四个目标杂质的一级与二级质谱图进行解析，最终鉴定出了4个杂质的结构。图3为杂质A和杂质C的肽序及b、y离子鉴定结果；杂质B与D也成功得以鉴定，分别为取代肽与插入肽杂质，但出于对客户的保密性要求，本推文未展示结构及质谱数据。
图3，杂质A、杂质C的肽序及b、y离子鉴定结果
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